Nach dem Tod ihrer Mutter wird die Waise Tristana (Catherine Deneuve) 1929 von ihrem Vormund Don Lope (Fernando Rey) aufgenommen. Der unverheiratete Großbürger lebt mit seiner Haushälterin Saturna (Lola Gaos) in Toledo. Er ist Mitte 50, hat nie gearbeitet und verfügt deshalb nur über eine spärliche Rente. Der Verkauf des von Tristanas Mutter hinterlassenen Hausrats bringt ihm zusätzlich etwas Geld ein, doch seine Eitelkeit lässt es nicht zu, dabei zu feilschen. Don Lope ist ein atheistischer Kirchengegner mit liberalen Überzeugungen aber einem altmodischen Ehrverständnis. Er hält sich für einen Frauenhelden und predigt seinen Freunden, Männer dürften durchaus promiskuitiv sein, aber sie müssten die Frauen herumkriegen statt sie zu zwingen. Außerdem seien die Frauen von Freunden tabu.

Weil das Haushaltsgeld nicht reicht und Don Lope das Trauerkleid nicht mehr sehen mag, das Tristana jeden Tag trägt, verhökert der Patriarch sein Silber und kauft dem Mädchen neue Kleider.

Nachdem Tristana im Glockenturm war, sieht sie in einem Albtraum den Kopf ihres Vormunds als Klöppel einer Glocke und schreit erschrocken auf. Daraufhin eilen Saturna und Don Lope zu ihr ans Bett.

Bei dem Albtraum hat sich Tristanas Nachthemd über der Brust geöffnet. Don Lope zieht es zu. Aber bald darauf defloriert er die Schutzbefohlene und erklärt ihr, sie sei nun nicht mehr nur wie eine Tochter für ihn, sondern zugleich seine Frau, auch ohne Trauschein. Trotzdem, so betont er mit generöser Geste, sei sie frei und könne ihn jederzeit verlassen. Im Widerspruch dazu besteht er darauf, dass Tristana das Haus auch weiterhin nur mit seiner Erlaubnis verlässt, denn er will sie unselbständig und ganz für sich.

Tristana fügt sich widerstandslos, aber nach zwei Jahren gesteht sie der Haushälterin bei einem ihrer heimlichen Spaziergänge, sie könne den alten Mann nicht mehr ausstehen und finde ihn nur noch lächerlich. Saturna soll ihr wieder ein eigenes Schlafzimmer herrichten.

Beim selben Spaziergang stoßen die beiden Frauen auf Passanten, die wegen eines streunenden Hundes, der angeblich Tollwut hat, die Polizei gerufen haben. Während Saturna zuschaut, wie ein Polizist dem Tier nachläuft und sich abmüht, es zu erschießen, gelangt Tristana in einen Patio, in dem ein junger Maler einen Katalanen porträtiert. Der Künstler, er heißt Horacio (Franco Nero), möchte auch Tristanas Gesicht malen und fordert sie auf wiederzukommen.

Tristana verliebt sich in Horacio, und er erwidert ihre Gefühle. Heimlich werden sie ein Liebespaar. Don Lope ahnt bald, dass Tristana einen anderen Liebhaber hat und trotz seines Geredes von Freiheit droht er sie im Fall eines „Fehltritts“ zu töten.

Horacio bleibt wegen Tristana länger als geplant in Toledo, aber schließlich muss er fort, und er drängt sie, mit ihm zu kommen. Er möchte sie heiraten, aber davon will sie nichts wissen. Während sie ihm beim Packen hilft, taucht Don Lope auf und fordert seinen Nebenbuhler zum Duell. Der Künstler geht nicht darauf ein, und als Don Lope ihn ohrfeigt, stößt er ihn zu Boden.

Tristana fährt mit Horacio weg. Saturna verabschiedet sich von den beiden am Bahnhof.

Zwei Jahre später bringt Horacio seine Geliebte nach Toledo zurück, entschuldigt sich bei Don Lope für sein früheres Benehmen und klärt ihn darüber auf, dass Tristana schwer krank sei. An ihrem Knie hat sich ein Tumor gebildet. Don Lope, der seine verhasste Schwester Josefina beerbt hat und reich geworden ist, nimmt die Kranke wieder auf.

Dr. Miquis (Fernando Cebrián) kann das Bein nicht retten. Er sorgt dafür, dass Tristana ins Krankenhaus gebracht wird, wo man ihr den Unterschenkel amputiert.

Durch die Krankheit und die Beinamputation ist Tristana erneut von Don Lope abhängig geworden. Ihr Versuch, sich mit Hilfe Horacios zu emanzipieren, ist gescheitert. Das verbittert sie. Um die frustrierte junge Frau aufzuheitern, springt Don Lope über seinen Schatten: Trotz seiner antiklerikalen Überzeugung lässt er zu, dass sie zur Messe geht. Und er fordert Horacio auf, Tristana jeden Tag zu besuchen, während er seinen Spaziergang macht und sich mit Freunden trifft. Außerdem kauft er ihr einen Flügel, denn als ihre Mutter noch lebte, spielte sie Klavier. Tristana beschwert sich jedoch bei Horacio, dass er sie hierher gebracht habe. Vergeblich weist er sie darauf hin, dass dies ihr ausdrücklicher Wunsch gewesen sei. Schließlich reist er ab.

Als Saturnas gehörloser Sohn Saturno (Jesús Fernández) im Garten steht, geht Tristana auf den Balkon hinaus. Der Junge fordert sie mit einer Geste dazu auf, ihren Morgenmantel zu öffnen, und sie zeigt ihm mit zynischem Lächeln ihren nackten, für ihn unerreichbaren Körper.

Der Pfarrer Don Ambrisio (Vicente Soler) rät Tristana, Don Lope zu heiraten. Wie von Don Ambrisio erwartet, geht Don Lope freudig auf den Vorschlag ein. Umso enttäuschter ist er, als Tristana ihn in der Hochzeitsnacht auslacht, weil er dachte, sie würde zu ihm ins Ehebett kommen.

Einige Zeit später erkrankt Don Lope. Nach einem Herzanfall geht es ihm so schlecht, dass er seine Frau anfleht, den Arzt zu rufen. Tristana geht zum Telefon, tut jedoch nur so, als spreche sie mit Dr. Miquis. Dann öffnet sie auch noch die Balkontüre, obwohl es draußen schneit und wartet hasserfüllt, bis Don Lope tot ist.