Ende 1935 wartet der belgische Meisterdetektiv Hercule Poirot (Albert Finney) in Istanbul auf den Orient-Express. Da ihm das Essen in der Türkei und im Nahen Osten zuwider ist, freut er sich, dass er wegen eines neuen Auftrags nach London gerufen wurde. Vor der Abreise trifft er Signor Bianchi, den Direktor der Bahngesellschaft, der auch den Zug nehmen will und sich persönlich darum kümmert, dass Poirot ein Bett im Schlafwagen nach Calais bekommt, obwohl er ausgebucht ist.

Im Speisewagen wird Poirot von Samuel Ratchett (Richard Widmark) angesprochen, einem reichen Amerikaner, der mit seinem Sekretär Hector McQueen (Anthony Perkins) und seinem Butler (John Gielgud) unterwegs ist. Weil er seit einigen Wochen Drohbriefe erhält, möchte er den berühmten Detektiv engagieren. Doch obwohl er bereit ist, dafür 15 000 Dollar zu zahlen, interessiert Poirot sich nicht für den Fall.

Nach einem kurzen Aufenthalt in Belgrad legen sich die Reisenden schlafen. Wegen der Geräusche wälzt Poirot sich noch lange in seinem Bett herum. Er hört, wie der Butler dem Amerikaner einen Schlaftrunk bringt, dieser seinen Sekretär kommen lässt und etwas mit ihm bespricht. Um 0.40 Uhr klingelt Ratchett nach dem Schlafwagenschaffner. Als Pierre an die Tür klopft und fragt, was los sei, heißt es von innen: „Es ist nichts. Ich hatte nur einen Albtraum.“

Am anderen Morgen klopft der Butler an die Kabinentür von Samuel Ratchett. Niemand antwortet. Der Schaffner und Hercule Poirot kommen dazu. Pierre versucht, die Tür mit seinem Schlüssel zu öffnen, aber er muss sie mit Gewalt aufdrücken, weil von innen die Sperrkette vorgelegt ist. Samuel Ratchett liegt tot im Bett. Ein Arzt, der sich unter den Reisenden befindet, stellt fest, dass er mit einem Medikament betäubt und dann durch zwölf unterschiedlich tiefe Messerstiche getötet wurde.

Bianchi ersucht seinen Freund, den Fall zu klären. Dafür ist Zeit, bis ein Schneepflug kommt und die Gleise vor dem Orient-Express freiräumt. Im nächsten Bahnhof möchte Bianchi nicht nur den Mord melden, sondern der Polizei auch gleich den Täter übergeben.

Als erstes fällt Poirot auf, dass es zu viele Spuren gibt. Auf einem halb verbrannten Papierschnipsel in Ratchetts Abteil entziffert er Teile des Namens Daisy Armstrong. In Mrs Hubbards (Lauren Bacall) Koffer steckt plötzlich die Uniform eines Zugschaffners, und daran fehlt ein Knopf, der im Abteil des Toten gefunden wird. Poirot befragt jeden der zwölf Fahrgäste, die ihre Plätze im Kurswagen nach Calais haben: Hector McQueen und den Butler, die neurotische schwedische Missionarin Greta Ohlsson (Ingrid Bergman), Prinzessin Natalia Dragomiroff und ihre Zofe Hildegarde Schmidt, den Autohändler Antonio Foscarelli (Denis Quilley), den ungarischen Grafen Andrenyi (Michael York) und dessen aus Deutschland stammende Ehefrau, eine geborene Helena Grünwald (Jacqueline Bisset), Oberst Arbuthnot (Sean Connery) und dessen heimliche Geliebte Mary Debenham (Vanessa Redgrave), Mrs Hubbard und den Schlafwagenschaffner Pierre. Dabei stellt er fest, dass sie alle eine Beziehung zu der Familie Armstrong auf Long Island hatten, deren kleine Tochter Daisy vor fünf Jahren entführt wurde. Obwohl die Eltern das geforderte Lösegeld bezahlten, ermordeten die Erpresser das Baby. Durch den Schock erlitt Sonya Armstrong eine Fehlgeburt und starb. Colonel Hamish Armstrong erschoss sich daraufhin. Und das zu Unrecht verdächtigte Hausmädchen Paulette nahm sich ebenfalls das Leben. Einer der Täter wurde auf dem elektrischen Stuhl hingerichtet. Aber der Mann, der das Kind umgebracht und das Lösegeld an sich genommen hatte, entkam der Polizei. Poirot durchschaut, dass Ratchett niemand anderes war als Cassetti, der Mörder des Armstrong-Babys. Zwölf Fahrgäste, zwölf Messerstiche, aus zwölf Buchstaben bestehende Drohbriefe, und in einem Mordprozess befinden zwölf Geschworene über Schuld bzw. Unschuld des Angeklagten.

Der Schneepflug erreicht gerade den blockierten Orient-Express. In Kürze wird die Fahrt fortgesetzt. Direktor Bianchi bittet die Fahrgäste in den Salonwagen, wo ihnen Hercule Poirot eröffnet, er habe zwei Theorien. Die erste ist einfach: Es handelte sich um einen Mafiamord. Der Mörder stieg in Belgrad als Schaffner verkleidet zu, ermordete Cassetti, wechselte die Kleidung und entkam unbemerkt. Die zweite Theorie ist komplizierter und sie würde einen Skandal auslösen: Der Butler servierte Cassetti ein Glas Wasser mit Baldriantropfen; McQueen schüttete ein Betäubungsmittel hinein und wartete bis 0.40 Uhr, dann klingelte er nach dem Schaffner und ahmte Cassettis Stimme nach, um den Detektiv nebenan zu täuschen. Erst gegen 2 Uhr morgens, als Poirot endlich schlief, schlichen sich die zwölf Verschworenen an Cassettis Bett, und jeder stach einmal mit einem Dolch auf ihn ein. Auf diese Weise rächten sie die Bluttat auf Long Island vor fünf Jahren. Dann verschlossen sie die Kabinentür von innen mit der Sperrkette und gingen durch die Zwischentür und die Nachbarkabine zu ihren Plätzen zurück.

Welche Lösung soll der jugoslawischen Polizei präsentiert werden? Poirot überlässt es Bianchi, und der entscheidet sich zur allgemeinen Erleichterung für die einfache Theorie.