Bei den Gebrüdern Grimm – Jacob („Jake“; Heath Ledger) und Wilhelm („Will“; Matt Damon) – handelt es sich um zwei Hochstapler und Schelme, die um 1800 durch deutsche Dörfer ziehen, die noch nicht vom Geist der Aufklärung berührt wurden. Jake war als Kind selbst auf einen Betrüger hereingefallen, der ihm statt Medizin eine Handvoll „Zauberbohnen“ angedreht hatte – und die kranke Schwester war deshalb gestorben. Inzwischen ist ein schrulliger Erfinder aus ihm geworden, der sich immer neue Tricks ausdenkt, mit denen er die Schreckensfantasien der ungebildeten Dorfbewohner in Szene setzen kann. Mit großem Brimborium vertreiben die Gebrüder Grimm dann Hexen und Geister, die nur in der Vorstellung der verängstigten Dörfler existieren – und lassen sich dafür gut bezahlen. Im Gegensatz zu seinem Bruder Will glaubt Jake allerdings selbst an Spuk und Dämonen.

General Delatombe (Jonathan Pryce), der Oberbefehlshaber der französischen Besatzungsmacht in Westdeutschland, will den mittelalterlichen Aberglauben der Deutschen ausrotten. Deshalb lässt er die Gebrüder Grimm festnehmen, die er als Scharlatane durchschaut, und beauftragt seinen italienischen Foltermeister Cavaldi (Peter Stormare), sie hinzurichten. Im letzten Augenblick ändert er seine Meinung. Die Gebrüder Grimm bekommen noch eine Chance: Sie werden unter Cavaldis Aufsicht nach Marbaden gebracht, einem Dorf, aus dem zehn kleine Mädchen verschwunden sind, und sollen den Fall aufklären.

Mit Hilfe von Angelika (Lena Heady), der Tochter des ebenfalls verschollenen Fallenstellers (Tomás Hanák), suchen Will und Jake Grimm nach den Kindern. Rasch merken sie, dass sie es mit einem wirklichen Zauberwald zu tun haben, in dem sich die Bäume bewegen. Sie sind froh, als Angelika sie wieder herausführt.

Es stellt sich heraus, dass in einem Turm mitten im Wald noch immer eine untote Thüringer Königin (Monica Belucci) haust, die eigentlich vor mehreren hundert Jahren bei einer Pestepidemie ums Leben gekommen war. Durch das Blut von zwölf unschuldigen Mädchen will die hässliche Alte ihre jugendliche Schönheit zurückgewinnen. Beschaffen lässt sie es sich von Angelikas Vater, der ihr hörig ist und als Werwolf sein Unwesen treibt.

Der General argwöhnt, dass die Gebrüder Grimm schon wieder dabei sind, Märchen zu erzählen. Den Zauberwald, dem einige seiner Soldaten zum Opfer gefallen sind, hält er für einen ihrer Tricks. Zornig befiehlt er, den Wald samt den Gebrüdern Grimm niederzubrennen, aber sie werden von Angelika aus den lodernden Flammen gerettet.

Dass ein elftes Mädchen von einem aus dem Dorfbrunnen gekletterten Lebkuchenmann entführt wird, können die Gebrüder Grimm nicht verhindern. Der Werwolf hat seine eigene Tochter als zwölftes Opfer ausersehen. Ehrerbietig bringt er die Ampulle mit dem Blut in den Turm hinauf und bildet sich dort ein, mit einer wunderschönen Königin zu tanzen.

Bevor die Königin Angelikas Blut trinken kann, zerstören die Gebrüder Grimm ihren Wandspiegel. Da zerspringt auch das Gesicht der Königin in tausend Scherben, denn sie besteht nur aus einem Spiegelbild.

Durch einen Kuss erweckt Jakob Angelika wieder zum Leben, und mit ihr erheben sich auch die anderen entführten Mädchen aus ihren Gräbern.

In Marbaden werden sie jubelnd empfangen, und die Dorfbewohner feiern ein Freudenfest.