Eigentlich hatte der reiche venezianische Kaufmann Pantalone seine Tochter Clarice einem jungen Geschäftspartner aus Turin versprochen: Federigo Rasponi. Als jedoch die Nachricht eintrifft, Federigo sei bei einem Degenduell ums Leben gekommen, dürfen Clarice und Silvio, der Sohn des Juristen Dottore Lombardi, auf die Erfüllung ihrer Träume hoffen. Pantalone und der Dottore werden sich über die geplante Hochzeit rasch einig.

Da taucht der Diener Truffaldino auf und kündigt Pantalone die Aufwartung seines Herrn an. Ein junger Edelmann betritt den Raum und gibt sich für Federigo Rasponi aus. In Wirklichkeit handelt es sich um Federigos Schwester Beatrice, die Männerkleidung trägt, um von Pantalone Gelder eintreiben und nach ihrem Geliebten Florindo Aretusi suchen zu können, der nach dem Duell mit ihrem Bruder aus Turin floh. Beatrice weist sich mit an Federigo Rasponi gerichteten Briefen aus, und Brighella, der aus Turin stammende Wirt des nahen Gasthauses, der das Geschwisterpaar kennt, bezeugt auf Beatrices Bitte hin wider besseres Wissen, dass es sich bei dem Besucher in der Tat um Federigo Rasponi handele. Da versichert der geschäftstüchtige Pantalone dem vermeintlichen Federigo Rasponi, dass Clarice wie geplant seine Frau werde. Das sich liebende Paar ist entsetzt, und der Dottore beschwert sich aufgebracht, aber Pantalone beruft sich auf die ältere Verpflichtung, die er halten müsse. Er ist froh darüber, denn er schätzt Federigo Rasponi für sehr viel reicher als Silvio Lombardi ein.

Durch Zufall begegnet Truffaldino in einer Gasse Florindo Aretusi, der soeben in Venedig eingetroffen ist. Als dieser ihn fragt, ob er sein Diener werden wolle, willigt Truffaldino ein, obwohl er bereits in Beatrices Diensten steht. Er wird „Diener zweier Herren“ und hält sich dabei für besonders schlau, denn so kann er zweifach essen und doppelten Lohn verlangen. Florindo steigt wie Beatrice in Brighellas Gasthaus ab.

Damit beginnt ein an Komplikationen reiches Verwirrspiel: Silvio will sich mit dem vermeintlichen Nebenbuhler Beatrice duellieren, sein Vater hat sich mit Pantalone überworfen, Clarice ist todunglücklich und will von dem ihr zugedachten Bräutigam nichts wissen, Beatrice und Florindo ahnen nicht, dass sie im selben Gasthaus wohnen, und Truffaldino hat als Diener zweier Herren alle Hände voll zu tun. Als er im Stress den Inhalts der Koffer von Beatrice und Florindo vertauscht, muss er sich rasch etwas ausdenken: Er erfindet kurzerhand einen zweiten Diener, der an allem schuld ist, erzählt Florindo, er habe bis vor ein paar Tagen einem bartlosen Herrn aus Turin gedient, der jedoch gestorben sei, und behauptet gegenüber Beatrice, zuletzt noch der Diener eines inzwischen verstorbenen Edelmanns aus Turin gewesen zu sein. Florindo, der weiß, dass Beatrice Männerkleidung anzog, um nach ihm suchen zu können, nimmt aufgrund von Truffaldinos Lügen an, seine große Liebe sei gestorben, und Beatrice hält Florindo für tot. Deshalb beschließen beide, sich das Leben zu nehmen. Dabei treffen sie jedoch im letzten Augenblick zufällig aufeinander und erkennen ihren Irrtum.

Als Pantalone erfährt, dass es sich bei dem Bräutigam seiner Tochter um eine Frau handelt, wendet er sich nach der ersten Verwirrung sogleich wieder an den Dottore und erklärt seine Bereitschaft, dessen Sohn mit seiner Tochter nun doch zu verheiraten. Glücklich fallen Silvio und Clarice sich in die Arme.

Bleiben noch Truffaldino und Clarices Kammermädchen Smeraldina, die sich ineinander verliebt haben. Smeraldina bittet Clarice, Beatrices Diener heiraten zu dürfen, und Truffaldino ersucht Florindo, bei Pantalone ein gutes Wort für ihn einzulegen. Weil Beatrice und Florindo noch immer davon ausgehen, zwei verschiedene Diener zu haben, wissen sie nicht, welchem der beiden sie den Vorzug geben sollen – bis Truffaldino notgedrungen die Wahrheit gesteht.

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