Am Festtag der Suppe strömen die Menschen im Königreich Dor vor dem Schloss zusammen, um bei der Präsentation der neuen Kreation des königlichen Kochs dabei zu sein. Die Ratte Roscuro, die mit einem Seemann gekommen ist, kann den Düften nicht widerstehen und schleicht sich in den Festsaal. Dort fällt sie ausgerechnet der Königin in die Suppe, und die stirbt vor Schreck.

Der König verbietet daraufhin den Tag der Suppe und verbannt die Ratten in ein finsteres Loch tief unter dem Schloss. Er trauert um die Gemahlin, und seine Tochter Pea um die Mutter. Die Sonne scheint nicht mehr, doch obwohl der Himmel Tag für Tag wolkenverhangen ist, regnet es nicht, und es vertrocknet alles.

In dieser schlimmen Zeit wird der Mäuserich Despereaux Tilling geboren. Er ist sehr klein und hat ungewöhnlich große Ohren. Offenbar hört, sieht und riecht er besser als die anderen Mäuse. Neugierig erkundet er die Umgebung. Dabei schreckt er vor nichts zurück und lernt beispielsweise, wie er blitzschnell den Käse aus einer Mäusefalle holen kann, ohne sich zu verletzen. Weil er anders ist als die anderen Mäuse, gilt er als Außenseiter. Sein Vater Lester Tilling und seine Mutter Antoinette machen sich deshalb große Sorgen. Immer wieder fordern sie ihn auf, sich ein Beispiel an seinem ängstlichen Bruder Furlough zu nehmen. Aber ihre Bemühungen, ihn zu einer „normalen“ Maus zu machen, sind vergeblich.

In der Schlossbibliothek liest Despereaux ein spannendes Buch. Die Geschichte handelt von einer eingesperrten Prinzessin, die von einem Ritter befreit wird. Die ritterlichen Tugenden Mut und Tapferkeit, Ehre und Wahrhaftigkeit gefallen Despereaux, und er macht sie sich zu eigen.

Eines Tages entdeckt er die traurig am Fenster stehende Prinzessin Pea. Er spricht sie an. Sie staunt über die sprechende Maus, die sich als „Gentleman“ bezeichnet, und unterhält sich eine Weile freundlich mit Despereaux.

Als Lester Tilling herausfindet, dass sein jüngerer Sohn verbotenerweise mit einem Menschen sprach, meldet er das Vergehen dem Mäuserat, um nicht selbst in Verruf zu kommen. Despereaux wird daraufhin in die lichtlosen Gewölbe unter dem Schloss verbannt.

Dort fangen ihn eines Tages die Ratten. Deren böser, zynischer Herrscher Botticelli Remorso hetzt zur Belustigung des Rattenvolkes in einer Arena einen Kater auf ihn. Im letzten Augenblick rettet Roscuro den Mäuserich, indem er behauptet, er habe Appetit auf ihn. Botticelli überlässt ihm den Gefangenen. Statt Despereaux zu fressen, bringt Roscuro ihn in seine Kammer, und die beiden werden Freunde.

Roscuro bedauert längst, all das Unglück verursacht zu haben. Was Despereaux ihm erzählt, lässt in ihm den Entschluss reifen, sich bei der traurigen Prinzessin zu entschuldigen. Doch als er sie anspricht, gerät sie in Panik, schreit und bewirft ihn mit allem, was ihr in die Hände kommt.

Aus Enttäuschung darüber ändert Roscuro seine Meinung. Statt Versöhnung will er nun Rache.

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Er bestärkt die im Schloss beschäftigte Dienstmagd Miggery („Mig“) Sow in der Meinung, ihr und nicht Pea gebührten die Privilegien einer Prinzessin. Mit Migs Hilfe verschleppt er die Prinzessin ins Rattenreich. Dort findet Mig sich plötzlich hinter Schloss und Riegel vor. Liegend auf einem fahrbaren Untersatz gefesselt wird Pea in die Arena gezogen.

Despereaux, der die Entführung beobachtete, eilt ins Schloss hinauf, um Hilfe zu holen, aber der König gibt sich noch immer seiner Trauer hin, und die anderen Mäuse halten Despereaux für ein Gespenst. Er kehrt zurück. Als die Ratten in die Arena stürmen, um die Prinzessin zu zerfleischen, lässt er den Kater aus dem Käfig, und die Ratten stieben erschrocken auseinander.

Zur gleichen Zeit bereitet der königliche Koch ungeachtet des Verbots eine neue Suppe zu. Der Duft löst die Wolken auf. Sonnenstrahlen dringen bis ins Rattenreich vor. Das Licht blendet Botticelli Remorso, und er wird vom Kater getötet.

Despereaux befreit Prinzessin Pea von ihren Fesseln. Sie dankt ihm, bedauert ihr Verhalten gegenüber Roscuro und nimmt dessen Entschuldigung an.

Inzwischen erkennt der Gefängniswärter Gregory in Mig seine Tochter. Nach dem Tod ihrer Mutter hatte er sie einem Bauern verkauft, der sie wie eine Sklavin schuften ließ und immer wieder verprügelte. Vor einiger Zeit veräußerte der Bauer sie zusammen mit den Schweinen, und schließlich kam sie als Magd ins Schloss. Gregory schließt Mig in die Arme und bittet sie um Verzeihung.